Home News About Us Contact Contributors Disclaimer Privacy Policy Help FAQ

Home
Search
Quick Search
Advanced
Fulltext
Browse
Collections
Persons
My eDoc
Session History
Login
Name:
Password:
Documentation
Help
Support Wiki
Direct access to
document ID:


          Display Documents



ID: 444392.0, MPI für molekulare Genetik / Department of Vertebrate Genomics
Detektion einzelsträngiger DNA mit der Hilfe von
DNAzymen
Authors:Hasselbach, David
Language:German
Date of Approval (YYYY-MM-DD):2008-08-19
Type of Thesis (e.g.Diploma):bachelor
Name of University:Universität Potsdam
Place of University:Potsdam
Physical Description 
(e.g. Total Number of Pages):
35
Audience:Experts Only
Table of Contents:1 Zusammenfassung 1
2 Einleitung 2
2.1 DNAzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2.2 Rolling circle amplication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.3 Zielstellung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3 Materialien und Methoden 6
3.1 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.1.1 Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.1.2 Puer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2.1 Ausbildung der DNAzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2.2 Luminometrische Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2.3 Photometrische Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.2.4 Standardisierung der Messsignale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.2.5 Untersuchung der Heminbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.2.6 Herstellung der RCA-Matrize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.2.7 RCA in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.2.8 Oberächenbehandlungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.2.9 Immobilisierung der DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3.2.10 Konformation und Messung an der Oberäche . . . . . . . . . . . . . . . . 12
4 Ergebnisse 13
4.1 DNAzyme in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.1.1 Standardisierung der Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.1.2 Optimierung der Messpuer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.1.3 Untersuchung des Hintergrundsignals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.1.4 Heminbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.1.5 Untersuchung der Konformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.1.6 Untersuchung der Sensitivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
4.1.7 Optimierung des Abstands zwischen benachbarten DNAzymen . . . . . . 17
4.2 RCA in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.2.1 Kontrollen der RCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.2.2 Optimierung der RCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
4.3 Immobilisierte DNAzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
4.4 RCA-Assay an der Oberäche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
5 Diskussion 23
5.1 Ausleseprinzipien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
5.2 Eigenschaften des verwendeten DNAzyms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
5.3 RCA in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
5.4 Oberächenkopplung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
5.5 DNAzym-Aktivität an der Oberäche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
5.6 RCA-Assay an der Oberäche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
5.7 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Literaturverzeichnis 27
Abstract / Description:In dieser Arbeit wurde eine katalytisch aktive einzelsträngige DNA (DNAzym), welche durch Bindung des Porphyrins Hemin eine Peroxidaseaktivität zeigt, auf ihre Anwendbarkeit für die Detektion oberächengekoppelter einzelsträngiger Nukleinsäuren überprüft. Ein an eine
Oberäche gekoppeltes DNA-Oligonukleotid sollte als Analyt dienen. In einem auf der rolling circle amplication (RCA) basierenden Assay sollte der Analyt kovalent mit einer Vielzahl an DNAzymen markiert werden und nach einer photometrischen bzw. luminometrischen Reaktion detektiert werden.
Für die Etablierung des Assays wurden zuerst die Eigenschaften des DNAzyms untersucht. Zur Bestimmung der Aktivität des DNAzyms wurde der Umsatz von ABTS und Luminol mit H2O2 gemessen. Dabei ergaben beide Puer die gleiche Sensitivität. Die Luminolmessung hatte einen stark eingschränkten Messbereich (1-50nM DNAzym), weshalb hauptsächlich mit dem ABTS als Substrat gearbeitet wurde. Mit dem Umsatz von ABTS konnten DNAzym-Konzentrationen von
1-1000nM detektiert werden konnten. Durch Aufnahme einer Michaelis-Menten-Kinetik wurde die Wechselzahl bezogen auf den ABTS-Umsatz von 0,631s bestimmt. Die Bindung des Hemins
an das DNAzym wurde untersucht und die Dissoziationskonstante mit KD = 0; 58  0; 31M
(T=298K) bestimmt. Es wurde gezeigt, dass der Abstand zwischen zwei DNAzymen auf einem Strang mindestens 25 Nukleotide betragen sollte, damit sich beide ausbilden.
Ein nicht immobilisierter Analyt sollte mit dem gewünschten Assay detektiert werden. Dies gelang mit nanomolaren Konzentrationen des Analyten. Dabei erhielt man einen stetigen Anstieg der Peroxidaseaktivität des DNAzyms bis zu einer RCA-Dauer von 40min. Eine Detektion eines an eine Oberäche gekoppelten Analyten war bisher nicht möglich. Eine
Bindung und eine RCA-Reaktion an der Oberäche konnte zumindest in geringem Maÿe nachgewiesen werden, die Peroxidaseaktivität der entstandenen DNAzym-Sequenzen jedoch
nicht.
Document Type:Thesis
Communicated by:Hans Lehrach
Affiliations:MPI für molekulare Genetik
External Affiliations:Universität Potsdam
Institut für Biochemie und Biologie
Full Text:
You have privileges to view the following file(s):
Hasselbach.pdf  [1,00 Mb]   
 
The scope and number of records on eDoc is subject to the collection policies defined by each institute - see "info" button in the collection browse view.