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          Institute: MPI für molekulare Genetik     Collection: Department of Human Molecular Genetics     Display Documents



  history
ID: 194767.0, MPI für molekulare Genetik / Department of Human Molecular Genetics
Isolierung und Charakterisierung
exprimierter Sequenzen im Bereich des MID1 Gens
Authors:Lehmann, Tanja
Language:German
Date of Approval (YYYY-MM-DD):2003
Name of University:Medizinische Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin
Place of University:Berlin
Physical Description
(e.g. Total Number of Pages):
87 S.
Audience:Experts Only
Table of Contents:1 Einleitung ............................... 6
1.1 Opitz Syndrom .......................... 6
1.2. Embryologie............................ 7
1.3 Das MID1-Gen ........................... 9
1.3.1 Klonierung, genomische Anordnung...... 9
1.3.2 Proteinfamilie ...................... 10
1.3.3 Mutationsanalysen.................... 11
1.3.4 Konservierung von MID1 in der Maus .. 12
1.3.5 Expression des MID1-Gens ............ 12
1.3.6 Funktion des MID1-proteins.............................. 13
1.4 Wachstumsfaktoren...................... 13
1.5 Fugu rubripes als Modellorganismus .... 14
1.6 Fragestellung und Zielsetzung................................ 15
2 Material und Methoden ................... 16
2.1 Material .............................. 16
2.1.1 Medien und Puffer ................... 16
2.1.2 Restriktionsenzyme .................. 17
2.1.3 Vektoren............................. 18
2.1.4 Primer .............................. 18
2.1.4.1 Primersequenzen im Fugu-Cosmid................................ 18
2.1.4.2 Primersequenzen in humaner MID1-cDNA.................................. 19
2.1.4.3 andere Primersequenzen............. 20
2.1.5 Zellinien ........................... 21
2.2 Methoden .............................. 22
2.2.1 Elektrophoresetechniken ............. 22
2.2.1.1 Horizontalgelelektrophorese........ 22
2.2.1.1.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese.... 22
2.2.1.1.2 RNA-Elektrophorese denaturierend.)............................ 22
2.2.1.2 Vertikalgelelektrophorese: Sequenzgel ........................................... 22
2.2.2 Nukleinsäuren Präparation ........... 23
2.2.2.1 Cosmid Präparation................. 23
2.2.2.2 Genomische DNA-Isolierung ......... 23
2.2.2.2.1 Aus Zellinien ................... 23
2.2.2.2.2 Aus Geweben ..................... 24
2.2.2.3 Plasmid-DNA-Isolierung............. 24
2.2.2.4 DNA-Isolierung aus Agarose ........ 24
2.2.2.5 Aufreinigung von PCR-Produkten .... 24
2.2.2.6 Total RNA-Isolierung................24
2.7 Poly-A+ RNA-Isolierung ................ 25
2.2.3 Klonierungstechniken ................ 25
2.2.3.1 Herstellung DH5a kompetenter Zellen E. coli ........................................... 25
2.2.3.2 Ligation -......................... 25
2.2.3.2.1 Dephosphorylierung des Vektors .. 25
2.2.3.2.2 Ligation „Sticky Ends“...................................... 26
2.2.3.2.3 Ligation „Blunt End“....................................... 26
2.2.3.2.4 TA-Klonierung für PCR-Produkte............................... 26
2.2.3.3 Transformation......................26
2.2.3.4 Restriktionsverdau................. 27
2.2.3.5 Deletionsklonierung................ 27
2.2.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR)...... 28
2.2.4.1 Standard-PCR....................... 28
2.2.4.2 Long-Distance-PCR ................. 28
2.2.4.3 RT-PCR ............................ 29
2.2.4.4 5’RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ........................................... 29
2.2.4.5 3’RACE ............................ 31
2.2.4.6 DNA Sequenzierung.................. 31
2.2.4.6.1 Sequenzreaktion.................. 31
2.2.4.6.2 Sequenzierung von Plasmiden...... 32
2.2.4.6.3 Sequenzierung von PCR-Produkten.. 32
2.2.4.6.4 Primer-Walking................... 32
2.2.5 Transfertechniken ................... 32
2.2.5.1 Southern Blot...................... 32
2.2.5.1.1 Trockenblot ..................... 32
2.2.5.1.2 Naßblot ......................... 33
2.2.5.2 Northern Blot ..................... 33
2.2.6 Hybridisierungstechniken ............ 34
2.2.6.1.1 Markierung und Aufreinigung radioaktiver DNA Sonden (1) ................................ 34
2.2.6.1.2 Markierung und Aufreinigung radioaktiver DNA-Sonden (2)............................. 34
2.2.6.2 Hybridisierung von Southern Blots...................................... 34
2.2.6.3 Hybridisierung von Northern Blots, Schnellhybridisierung ..................... 35
2.2.6.4 Autoradiographie .................. 35
2.2.6.5 Herstellung von Hybridisierungsproben ........................................... 35
2.2.7 Zellkultur........................... 36
2.2.7.1 Umsetzen von Zellinien ............ 36
2.2.7.2 Einfrieren von Zellinien .......... 36
2.2.7.3 Auftauen von Zellkulturen ......... 36
2.2.7.4 Ernten von Zellen ................. 36
2.2.7.5 Wachstumsfaktor-Stimulationsessay . 37
2.2.8 Computerprogramme ................... 38
2.3 Abkürzungen ........................... 38
3 Ergebnisse .............................. 39
3.1 Arbeitsplan ........................... 39
3.1.1 Suche nach neuen exprimierten Exons...................................... 39
3.1.2 Charakterisierung der MID1-Transkriptionsregulation ........................................... 39
3.2 MID1-Ortholog bei Fugu rupripes........ 40
3.2.1 Cosmidauswahl........................ 40
3.2.2 Cosmidsequenzierung.................. 41
3.2.3 Cosmidanalyse........................ 44
3.3.1 Nukleotidebene ...................... 44
3.3.2 Proteinebene......................... 44
3.4 Untersuchung der Exonvorhersagen ...... 49
3.4.1 Zoo-Blot Untersuchungen ............. 54
3.5 Promoteranalyse ........................................... 57
3.6 Humane MID1-Transkription ............. 58
3.6.1 Modellsystem: Zellinie 18/98 ........ 58
3.6.2 Suche nach neuen exprimierten Sequenzen.................................. 58
3.6.2.1 ORF................................ 58
3.6.2.2 3’UTR.............................. 60
3.6.2.3 5’UTR.............................. 61
3.6.3 Charakterisierung der MID1-Transkriptionsregulation ........................................... 62
3.6.3.1 Expressionsstudien .................62
3.6.3.2 Charakterisierung der MID1-Transkripte ........................................... 63
3.6.4 MID1-Transkription bei OS-Patienten.. 64
3.6.4.1 OS-Patient 5174 ................... 64
3.6.4.2 OS-Patient 165/98 ................. 66
3.7 MID1 und Wachstumsfaktor TGF-beta3 .... 70
3.7.1 MID1-Transkription und TGF-beta3 .... 70
3.7.2 TGF-beta3 spezifische MID1-Regulation bei OS-Patient 165/98 .................................... 71
4 Diskussion .............................. 72
4.1 Suche nach exprimierten Sequenzen ..... 72
4.1.1 Das Fugu MID1-Ortholog .............. 72
4.1.2 Fugu-Exons .......................... 73
4.2 Regulationsstudien auf Transkriptionsebene ........................................... 75
4.2.1 MID1-Transkription................... 76
4.2.2.1 Regulatorische Elemente des MID1-Gens.................................. 76
4.2.3 MID1-Transkription in OS-Patienten...................... ........ 77
4.2.3.1 MID1-Transkription - OS-Patient 5174 ........................................... 77
4.2.3.2 MID1-Transkriptionsregulation - OS-Patient 165/98 ........................................... 78
4.2.4 MID1-Promoter ....................... 79
4.3 Ausblick .............................. 80
5 Zusammenfassung ......................... 82
6 Literatur................................ 83
Document Type:PhD-Thesis
Communicated by:Hans-Hilger Ropers
Affiliations:MPI für molekulare Genetik
External Affiliations:Humboldt-Universität zu Berlin
Full Text:
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